ICS 11.220 SN B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5124—2019 猪Delta冠状病毒检疫技术规范 Quarantineprotocolfor porcine deltacoronavirus 业标准信息服务平台 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5124—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则进行编写。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国天津海关、中国检验检疫科学研究院、 浙江大学、中华人民共和国昆明海关、中华人民共和国上海海关。 张舟、花群义、张强、李健。 业标准信息服务平台 SN/T5124—2019 猪Delta冠状病毒检疫技术规范 1范围 本标准规定了猪Delta冠状病毒分离、RT-PCR和荧光RT-PCR诊断技术。 本标准适用于猪Delta冠状病毒感染的临床诊断和实验室检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件： dNTPs脱氧核糖核苷酸 LLC-PK细胞猪肾小管上皮细胞 PDCoV Porcinedeltacoronavirus RT-PCR逆转录-聚合酶链反 业标准信息服务平台 4仪器设备 4.1二氧化碳培养箱 4.2 倒置显微镜 4.3 PCR 仪 4.4 荧光定量PCR仪 4.5 台式冷冻离心机 4.6 生物安全柜 4.7 分析天平 4.8 微量可调移液器（10uL、100uL、1000uL）及配套带滤芯吸头等。 5 试剂和材料 5.1水：本标准所用水应符合GB/T6682中三级水的规格 5.2DMEM/F12培养基 5.3氯仿 5.4Trizol 5.5逆转录酶 1 SN/T5124—2019 5.6DNA聚合酶 5.7RNA酶抑制剂 5.8RT-PCR用引物，序列如下： 上游引物：5²-ATCCTCCAAGGAGGCTATGC-3' 下游引物:5²-GCGAATTCTGGATCGTTGTT-3" 5.9荧光RT-PCR用引物和探针，序列如下： 上游引物：5²-CGACCACATGGCTCCAATTC-3 下游引物：5-CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT-3 探针:5'-FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGC-TAMRA-3" 6概述 PDCoV为单股正链、含囊膜的RNA病毒，基因组纳为25kb，包含5和3非编码区及7个开放性 阅读框，分别编码多聚酶蛋白（polymeraseprotein）la/1b、纤突（spike，S）蛋白、小膜（Envelope，E）蛋 白、膜（Membrane，M)蛋白、非结构蛋白6（nonstructuralprotein6，NS6）核衣壳（Nucleocapsid，N）蛋 白及非结构蛋白7（nonstructuralprotein7NS7）。 PDCoV引发的疾病以呕吐、水样腹泻、脱水和食欲下降为基本特征，各年龄段猪群均易感，新生仔 猪感染率和发病率较高，感染后死亡率为30%～40%。病理学特征主要表现为小肠扩张，肠壁变薄、透 明，内充满黄色液体，肠系膜充血，肠系膜淋巴结水肿，小肠绒毛缩短。组织病理学变化可见十二指肠、 空肠、回肠绒毛严重萎缩甚至脱落，上皮细胞坏死或空泡化 7实验室诊断 7.1病毒分离 7.1.1样品处理 粪便或肠内容物用含10000IU/mL青霉素、10000μg/mL链霉素和25μg/mL两性霉素B的 0.01mol/LPBS（参加附录A)1：10稀释（w/v），充分震荡混勺，12000转/分钟离心20min，取上清以 0.22um过滤器过滤除菌。 后，12000转/分钟离心20min，取上清以0.22um过滤器过滤除菌。 7.1.2病毒的细胞分离 7.1.2.1将长势良好的LLC-PK细胞分装，加人含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃、5% CO,培养。 7.1.2.2细胞生长至80%融合度时，弃去旧培养基，以不含血清的DMEM/F12清洗两遍。 7.1.2.3加入1mL过滤除菌后的样品上清液，同时加入含10000IU/mL青霉素，10000ug/mL链霉 7.1.2.4每天观察接种细胞是否出现细胞病变，并记录结果，连续观察3天。 7.1.2.5若空白对照细胞正常，阳性对照组细胞产生细胞病变，同时接种样品的细胞也产生细胞病变 （细胞圆缩、聚集、脱落），收集病变细胞，用于核酸抽提和PCR鉴定。 7.1.2.6若接种样品的细胞未出现细胞病变，则收集细胞，反复冻融，10000rpm/min离心10min，取 上清接种新鲜LLC-PK细胞单层，继续培养3天后收集细胞，用于核酸抽提和PCR鉴定。 2