ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 19495.9—2017 转基因产品检测 植物产品液相芯片检测方法 Detection of genetically modified organisms and derived products- Liquid bead array detection for plant products 2018-07-01实施 2017-12-29发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19495.9—2017 前言 GB/T19495《转基因产品检测》已经或计划发布以下部分： GB/T 19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义； -GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求； GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法； GB/T19495.4 转基因产品检测 核酸定性PCR检测方法； GB/T19495.5 转基因产品检测 核酸定量PCR检测方法； -GB/T19495.6 转基因产品检测 基因芯片检测方法； GB/T19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法； GB/T 19495.8 转基因产品检测 蛋白质检测方法； GB/T 19495.9 转基因产品检测 植物产品液相芯片检测方法； -GB/T19495.10 转基因产品检测 植物产品通用检测方法； GB/T 19495.11 转基因产品检测 植物产品数字PCR检测方法； GB/T19495.12 转基因产品检测 首藉实时荧光PCR检测方法。 本部分是GB/T19495的9部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本部分由中国检验检疫科学研究院起草。 本部分主要起草人：王慧煜、付伟、杜智欣、韩雪清、魏霜、梅琳、朱鹏宇、刘佳佳、王晨光、邓婷婷、 朱水芳、陈颖。 1 GB/T19495.9—2017 转基因产品检测 植物产品液相芯片检测方法 1范围 GB19495的本部分规定了转基因成分的液相芯片定性检测方法。 本部分适用于玉米、大豆、油菜、水稻、棉花等转基因植物及其产品CaMV35S和NOS基因的定性 检测。 2 规范性引用文件 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction） MFI：中位荧光强度值（MedianFluorescenceIntensity） SA-PE：链霉亲和素-藻红蛋白（StreptavidinR-Phycoerythrin） 4原理 液相芯片技术以荧光编码微球为基础，微球表面带有大量的活性基团，可与核酸探针、抗原、抗体等 分子偶联。微球在制备过程中掺入了红色和橙色两种染料按照比例混合而成的荧光染料，两种染料分 通过不同配比赋予了微球不同的颜色，从而把微球分为很多种，每种微球特异性的偶联针对目的DNA 序列的寡核苷酸探针，就可以标记100种不同的探针分子。然后依次加人目的分子和带有荧光的报告 分子，不同微球上的探针分子与不同的目的分子实现特异性结合，形成一个灵活性的液相芯片系统。该 方法的信号识别与检测技术是流式细胞术，它可以将微球体快速排成单列通过检测通道，使用红色和绿 色两束激光对单个微球进行照射，红色激光通过分辨微球本身的光谱学指纹将微球分类对反应进行定 性；绿色激光通过检测微球上结合的荧光报告分子量对反应进行定量。所得到的荧光信号经过光电倍 增管后经电脑处理，最后对数据进行分析，得出结果。检测时，液相芯片检测仪只记录两种荧光同时出 现时的荧光信号，不记录未结合的荧光报告分子信号。 本标准针对通用筛选元件CaMV35S启动子和NOS终止子设计选取特异性引物和探针进行液相 芯片检测，并根据检测结果来判定CaMV35S启动子和NOS终止子的外源筛选元件成分 1 GB/T19495.9—2017 5试剂与材料 除非有特殊说明，仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。 5.1DNA提取试剂盒 推荐针对不同的样品基质类型选取不同的基因组提取试剂盒。 5.2 218srRNA基因引物和探针 18s-F:5′-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3 18s-R:5′-生物素-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3" 18s-P:5'-氨基-12个碳基-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3 5.3 3CaMV35S启动子基因引物和探针 CaMV35S-F:5²-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3 CaMV35S-R:5'-生物素-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3" 5.4NOS终止子基因引物和探针 NOS-F:5'-CATGTAATGCATGACGTTATTTATG-3" NOS-R:5'-生物素-TTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGT-3" NOS-P:5’-氨基-12个碳基-ATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAA-3 5.5 5荧光微球 5.6 510×PCR缓冲液 用于PCR扩增反应，含有Tris-HCl(pH8.3）、KCI和MgCl2。 5.7dNTP溶液 含有dATPdTTP、dCTP和dGTP(各2.5mmol/L)。 5.8 3ExTaqDNA聚合酶 具有3'-→5核酸外切酶活性的耐热性DNA聚合酶（5IU/μL)。 5.9 9TMAC杂交液 氯化四甲胺（tetramethylammoniumchloride）杂交液 6仪器与设备 6.1Ⅱ级生物安全柜。 6.2涡旋震荡仪。 6.3PCR仪，平均温度变化速度0.1℃/s。 2