ICS 65.020.30 B 41 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB13/T 2609—2017 禽流感病毒与新城疫病毒二重 RT-PCR 检测方法 2017 - 11 - 22 发布 河北省质量技术监督局 2017 - 12 - 22 实施 发 布 DB13/T 2609—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北农业大学提出。 本标准起草单位：河北农业大学。 本标准主要起草人：袁万哲、刘聚祥、陈立功、孙继国、董世山、武现军、刘静、张磊、李睿文、 李丽敏、白云、韩庆安。 I DB13/T 2609—2017 禽流感病毒与新城疫病毒二重 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了禽流感病毒与新城疫病毒RT-PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽流感病毒与 新城疫病毒。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 EB：溴化乙锭（ethidium bromide） DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reverse-transcription polymerase chain reaction） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） 3 试剂或材料 包括LS TRIzol RNA提取试剂或各种市售病毒核酸提取试剂盒，氯仿，异丙醇，75%乙醇，1.0％琼 脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭（EB，10 ug/μL）或核酸染料，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的 灭菌的双蒸水，DNA分子量标准（100 bp），2×Taq MasterMix。 警示:氯仿属中等毒性，在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应 立即冲洗；电泳中用到的EB在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要进行无害化处理；DEPC 在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。 3.1 LS TRIzol RNA 提取试剂或病毒核酸提取试剂盒。 3.2 氯仿:又名三氯甲烷。 3.3 1.0％琼脂糖凝胶，配制方法见附录 A 中 A.1。 3.4 50×TAE 缓冲液，配制方法见附录 A 中 A.2。 3.5 溴化乙锭（EB，10 ug/μ L）或核酸染料，配制方法见附录 A 中 A.3。 3.6 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，配制方法见附录 A 中 A.4。 3.7 DNA 分子量标准（100 bp）:包含 100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp、2000bp 几种分 子量标准。 3.8 反转录酶:M-MLV 反转录酶（200 U/μ L）或 AMV 反转录酶（10 U/μ L）。 1 DB13/T 2609—2017 3.9 RNA 酶抑制剂。 3.10 2×Taq MasterMix:含有 PCR 缓冲液、酶混合物、dNTP 混合物、无 RNA 酶的水等。 3.11 dNTP。浓度为 2.5mM。 3.12 引物:反转录引物、上游引物与下游引物见附录 B 中的表 B.1。引物浓度为 10 μ mol/L。 4 仪器设备 4.1 PCR 仪:温度范围 4.0℃～99.9℃,样品基座配置至少包括单个 0.2 mL 孔。 4.2 凝胶成像系统:检测灵敏度 DNA ≥0.1ng；有效像数 1360×1024、10 bit、USB 2.0。 4.3 台式低温高速离心机:最高转速 16000 r/min；容量 1.5 mL × 12。 4.4 电泳仪:电压 50 V～120 V，电流 10 mA～800 mA，定时 0 min～999 min。 4.5 电泳槽:耐高温、耐腐蚀、不漏液；缓冲液容量充足。 4.6 冰箱:具有冷藏功能。 4.7 微量移液器:单道可调,量程包括 0.5μ L～10 μ L、2μ L～20 μ L、10μ L～100μ L、100μ L～1000 μ L。 4.8 水浴锅:温度范围为室温～100℃。 5 样品 5.1 阴阳性对照 以灭活的禽流感病毒与新城疫病毒鸡胚培养物或者感染禽组织作为阳性对照，以正常鸡胚尿囊液 或者是正常家禽组织作为阴性对照。对照均应在-20℃保存。 5.2 样品的采集与处理 5.2.1 采集工具 下列的采集工具应经121℃±2℃，20 min高压灭菌并烘干： a) 棉拭子； b) 剪刀； c) 镊子； d) 1.5 mL 离心管； e) 研钵。 5.2.2 棉拭子采集 将棉拭子深入咽喉或肛门转一圈； 将采集后的棉拭子放入盛有1.0 mL PBS （配制方法见附录A中A.5） 的1.5 mL的离心管，加盖，编号。 5.2.3 组织采集 2 DB13/T 2609—2017 剖检家禽，用剪刀采集心肝脾肺肾法氏囊等组织，装入一次性灭菌容器，编号。 5.2.4 样品储运 样品采集后放入塑料袋内密封（一个采集点的样品放一个塑料袋内），于保温箱中加冰，密封24 h 内送至实验室。 5.2.5 样品的处理 5.2.5.1 棉拭子处理方法 将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，4℃条件 下3000 r/min离心15 min，取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中，编号备用。 5.2.5.2 组织的处理方法 将所采集的组织至于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比（1:5）加入样品保 存液进行充分研磨，4℃条件下3000 r/min离心15 min。取上清转入无菌的1.5 mL的离心管备用，编号。 6 操作步骤 6.1 RNA 的提取 6.1.1 用 LS TRIzol 试剂提取待检样品（棉拭子或组织）、阳性对照及阴性对照样品的 RNA。 6.1.2 将 250 μ L 经过预处理的待检样品（棉拭子或组织）加入 750 μ L TRIzol LS Reagent 中，振 荡 2 min，室温放置 5 min。 6.1.3 加入 250 μ L 氯仿，在微量振荡器上振荡 1 min，室温放置 5 min 后，4℃条件下 12000 r/min 离心 15 min。 6.1.4 吸取上层水相转入一新的离心管中，加入等量的异丙醇，混匀，室温放置 15 min，4℃条件下 12000 r/min 离心 15 min。 6.1.5 小心吸弃上清，加入 DEPC 处理的 75%乙醇 700 μ L～800 μ L，4℃条件下 12000 r/min 离心 5 min。 6.1.6 小心吸弃上清，将沉淀自然风干或于 50℃干燥箱中晾干，加适量的 DEPC 水溶解。 6.1.7 提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增，若需长期保存，应至于-80℃的冰箱保存。 6.1.8 也可采用商品化的病毒核酸提取试剂，按照说明书进行如下操作。同时进行阴阳对照样品 RNA 的提取。 6.1.8.1 加入 20 μ L 蛋白酶 K 于 1.5 mL 离心管中，在离心管中加入 200 μ L 样品，加入 200 μ L BB5， 涡旋混合 15 s，56℃孵育 15 min。 6.1.8.2 加入 250 μ L 无水乙醇，涡旋混合 15 s，室温放置 5 min。 6.1.8.3 将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000 r/min 离心 1min，弃掉流出液。 6.1.8.4 加入 500 μ L WB5，12000 r/min 离心 1min，弃掉流出液，重复一次。 3 DB13/T 2609—2017 6.1.8.5 室温 12000 r/min 离心 1min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置 1～3 min 彻底晾干离心柱。 6.1.8.6 将离心柱转入 1.5 mL 离心管中，并向离心柱中央加 20 μ L RNase-free Water，室温静置 1min。 6.1.8.7 室温 12000 r/min 离心 1min，洗脱 RNA。 6.1.8.8 提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增，若需长期保存，应至于-80℃的冰箱保存。 6.2 RT-PCR 6.2.1 反转录反应（cDNA 的合成） 取上述步骤所得的RNA 11 μL，加入2 μL 10 µmol//L的反转录引物（AIV/NDV-RT），4 μL 5×反 转录缓冲液、0.5 μL反转录酶、0.5 μL RNA酶抑制剂、2 μL dNTP Mixture至20 μL，42℃水浴1 h， 即得到cDNA溶液，直接用于下面的PCR扩增或-20℃冻存备用。 6.2.2 PCR 反应 在反应管中依次加入8 μ L无核酸酶水、10 μ L 2×Taq MasterMix、1 μ L上述cDNA溶液、各0.5 μ L 10µmol/L的上游引物（AIV-decF与NDV-decF）、各0.5 μ L 10 µmol/L的下游引物（AIV-decR与NDV-decR）。 经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。 PCR扩增条件：94℃预变性3 min，94℃变性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸25 s，循环30次；72℃ 延伸5 min。扩增反应结束后立即进行电泳或置于4℃条件下备用。 7 试验数据处理 7.1 扩增产物的电泳检测 制备1.0%琼脂糖凝胶板。在电泳槽内加入1×TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取3 μL～5 μL 扩增产物加到凝胶孔，加入DNA分子量标准（100 bp）。恒压（110V）电泳30 min～40 min，将电泳好 的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。 7.2 结果判定 阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性的条带，阴性的扩增产物 没有预期的目的条带，阴阳性同时成立表明试验有效，否则试验无效。在试验结果成立的前提下，如 果样品的RT-PCR产物电泳后在428 bp位置出现特异性的条带，则判定为禽流感病毒核酸检测阳性；如 果样品的RT-PCR产物电泳后在297 bp位置出现特异性的条带，则判定为新城疫病毒核酸检测阳性。如 果样品的RT-PCR产物电泳后在428 bp和297 bp位置均出现特异性的条带，则判定为禽流感病毒与新城 疫病毒核酸检测双阳性；如果样品的RT-PCR产物电泳后在428 bp和297bp位置均未出现特异性的条带， 则判定为禽流感病毒与新城疫病毒核酸检测双阴性。RT-PCR产物电泳图见附录C中C.1。 8 试验报告 依次陈述