SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4737—2016 猪及其产品中特定转基因成分 实时定量PCR检测方法 Protocol of the real-time PCR for detecting genetically modified component in pigs and their derived products 行业标准信息服务平台 2016-12-12发布 2017-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4737—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国农业科学研究院北京畜牧兽医研究所、中华人民 共和国山东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：林祥梅、王勤、李晓琳、朱振营、刘建、李奎、潘登科、孙敏、付伟、刘晓飞、梅琳、 刘丹丹、仇松寅。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4737—2016 猪及其产品中特定转基因成分 实时定量PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪及其产品中特定转基因成分的实时定量PCR检测方法。 本标准适用于转脂肪酸去饱和酶基因、转植酸酶基因、肌肉生长抑制素基因敲除猪及其产品的 检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 APPA：植酸酶（Phytase） MSTN：肌肉生长抑制素（Myostatin） PCR：聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction) sFat-1：w-3脂肪酸去饱和酶基因（omega-3fattyaciddesaturase） TE:Tris-HCI、EDTA 缓冲液 4防污染措施 怡息服务平台 猪及其产品中特定转基因成分实时定量PCR检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的 规定。 5 实时定量PCR试验 5.1主要仪器 5.1.1 实时荧光定量PCR仪。 5.1.2 超净工作台。 5.1.3 消毒灭菌锅。 5.1.4 核酸蛋白分析仪。 5.1.5 高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。 5.1.6 低温冰箱，冷藏冷冻冰箱。 1 SN/T 4737—2016 5.1.7 纯水器，双蒸水器。 5.1.8 漩涡震荡器。 5.1.9 微量进样器：2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。 5.2 主要试剂 5.2.1 实验用水：符合GB/T6682中一级水的规格。 5.2.2TagDNA聚合酶，三氯甲烷，异丙醇，异戊醇，70%乙醇，TE缓冲液，50倍TAE电泳浓缩缓冲 液，细胞裂解缓冲液，蛋白酶K，醋酸钠（NaAc）。药品及试剂配制方法见附录A。 5.3 引物和探针 按照表1中提供的引物和探针序列合成引物及探针，配制成10pmol/μL用于PCR检测，扩增序列 参见附录B。 表1# 检测转基因猪内外基因所需的引物序列 被检测基因 基因来源 引物序列 探针序列 备注 5'GAAGGTTCAGGTTTACTCACG3' 5'CCCAGCGGAAAACGG Sus β2M 猪内源 内参照 5'TCAGCAAATCAATTTCAATCTG3' AAAGCCAA3' 5'TGCAGGTCAATTCT 5AGGGTAGGAAAGTGATTCAGGATCT3 MSTN基因 MSTN 内源 5'CAGACTGCCTTGGGAAAAGC3' MGB3' 敲除猪检测 5'TGAATGAAGCACGCA 5'TGTTCGTTGGCAGGTTTTAC3 转植酸酶 APPA 外源 5'AGATGGCTGGCAACTAGAAG3 TACCGGC3' 基因猪检测 转w-3脂 5'TGTACGAGGCTGATGAATGG3' 5'TGTGTCCAATCCGAGT sFat-1 外源 肪酸去饱和酶 5'TGTCCGTCTGTGATATGGTG3' CCATAGTAACGA3' 基因检测 5.4 ，试验步骤 5.4.1 样品采集 采集动物的组织块作为检测样品，将其放人无菌Eppendorf管中，编号备用。 采集过程中样品不得交叉污染，采集及样品前处理过程中应戴一次性手套。 5.4.2样品存放 对于采集的样品放置在一70℃冰箱或液氮中，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。 5.4.3样品核酸的提取 5.4.3.1取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加人1mL的细胞 裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转人1.5mL离心管中，加入蛋白酶K（20mg/mL）和胰RNA酶 （20mg/mL）各5μL，混。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12h~24h，间歇 振荡离心管数次。于台式离心机以12000r/min离心5min，取上清液转人另一离心管中。 5.4.3.2加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100μL吸头挑出，晾干，用200μLTE重 新溶解（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）。 2