ICS 65.020.01 SN B 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4877.15—2019 基因条形码筛查方法 第15部分：检疫性叶点霉 DNA barcoding screening method- Part 15: Quarantine Phyllosticta spp. 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T 4877.15—2019 前言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为15个部分： 第1部分：检疫性棒形杆菌； 第2部分：检疫性黄单胞菌； 一 一第3部分：检疫性植原体； 一 第4部分：检疫性茎点霉； 一第5部分：检疫性拟茎点霉； 一第6部分：检疫性嗜酸菌； 一第7部分：检疫性轮枝菌； 一第8部分：检疫性炭疽菌； 一第9部分：检疫性腥黑粉菌； 一第10部分：检疫性疫霉； 一第11部分：检疫性异株苋亚属； 一第12部分：黄瓜绿斑驳花叶病毒； 一第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒； 文本为准 一第14部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒 第15部分：检疫性叶点霉。 本部分为SN/T4877的第15部分。 本部分依据GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院、中华人民共和国宁波海关、中国科学院微生物研 究所、中国检验检疫科学研究院 本部分主要起草人：段维军、蔡磊、郭立新、陈倩、段丽君、李雪莲、刘芳、赵文军、陈先锋。 信息服务平台 I SN/T 4877.15—2019 基因条形码筛查方法 第15部分：检疫性叶点霉 1范围 本部分规定了检疫性叶点霉DNA条形码筛查方法。 本部分适用于进境植物及其产品中检疫性叶点霉的筛查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2589植物病原真菌检测规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1检疫性叶点霉属真菌 出版文本为 葡萄苦腐病菌Greeneriauvicola（Berk.etM.A.Curtis）Punithalingam（现用名为Phyllostictaam M.A.Curtis）。分类地位：叶点霉属（Phyllosticta）、球壳孢科（Phyllostictaceae）、葡萄座腔菌目（Botryo sphaeriales）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、子囊菌门（Ascomycota）。 3.2凭证标本(Voucherspecimen) 凭证标本是一种为鉴定或研究提供实物依据并具有足够存档信息（采集及鉴定信息等）而长期保存 的标本，它可以是完整的生物个体或其一部分，也可以是生物体的遗传物质凭证标本的保存需要有详 细的标本编号、存放地点等详细信息，以便于日后查证。 3.3DNA条形码（DNAbarcode) DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA 用于鉴定检疫性叶点霉属的DNA条形码如下： 核糖体基因转录间隔区（InternalTranscribedSpacer，简称ITS） 4方法原理 根据叶点霉属真菌的核糖体转录间隔区（ITS)的序列特征，应用DNA条形码技术对检疫性叶点霉 进行种类筛查，确定目标真菌是否为检疫性叶点霉及其种属归类。 1 SN/T 4877.15—2019 5仪器用具和试剂 5.1仪器设备与用具 显微镜、高压灭菌锅、超净工作台、组织破碎仪、恒温水浴锅、台式冷冻离心机、微量分光光度仪、电 子天平、超纯水仪、漩涡振荡器、冰箱、微量移液器（0.5μL，2.5μL，10μL，20μL，200μL，1000μL）、常 规PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统、DNA提取仪。 5.2主要试剂 购置如下试剂或者相应的真菌基因组提取试剂盒：乙二胺四乙酸钠盐（NazEDTA·2H,O）、氢氧 化钠（NaOH）、Tris碱、浓盐酸（HCI）、溴化十六烷基三甲铵（CTAB）、氯化钠（NaCI）、聚乙烯吡咯烷酮 （PVP）、冰醋酸（CH.COOH）、蒸馏水、氯仿（CHCl.）、异戊醇、70%乙醇。 PCR和电泳检测所需试剂：10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、ExTaq聚合酶、引 物、超纯水、DL2000Marker、琼脂糖、GelRed核酸凝胶染料。 6筛查鉴定方法 6.1样品的采集与处理 本为准 样品的采集、分离、纯化和培养参照SN/T2589植物病原真菌检疫鉴定方法进行。 6.2核酸的制备 版 采用基因组提取试剂盒制备DNA，或采用改良的CTAB提取法，参见附录A。 6.3DNA纯度与浓度的测定 用微量紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核 酸的纯度和浓度，计算公式如下： DNA纯度=OD260/OD280 DNA浓度=50×OD260μg/mL 6.4序列扩增测序 利用通用引物对ITS基因进行扩增测序（具体步骤见附录B），将序列在Genbank数据库或中国检 疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对，若与数据库中叶点霉属ITS基因序列相似性均大于 98%，则比对分析序列同源性。 7纟 结果判定 ITS基因序列长度大于5O0bp，在NCBI数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行 比对分析，若与数据库中叶点霉属ITS基因序列（参见附录C)同源性大于98%，则判定该菌为叶点 霉属。 若测定序列与附录D检疫性叶点霉ITS参考序列同源性为100%，则判定该菌为葡萄苦腐病菌。 2