SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4877.9—2017 基因条形码筛查方法 第9部分：检疫性腥黑粉菌 DNA barcoding screening method-Part 9 :Quarantine Tilletia 行业标准信息服务平台 2017-08-29发布 2018-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4877.9—2017 前 言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10个部分： 第1部分：检疫性棒形杆菌； 第2部分：检疫性黄单胞菌； 第3部分：检疫性植原体； 一第4部分：检疫性茎点霉； 第5部分：检疫性拟茎点霉； 一第6部分：检疫性嗜酸菌； 第7部分：检疫性轮枝菌； 第8部分：检疫性炭疽菌； 第9部分：检疫性腥黑粉菌； 第10部分：检疫性疫霉。 本部分为SN/T4877的第9部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。 本部分主要起草人：程颖慧、章桂明、王颖、高瑞芳、汪莹、潘广、向才玉、冯建军、史亚千、王红英、 谢晓露。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4877.9—2017 基因条形码筛查方法 第9部分：检疫性腥黑粉菌 1范围 SN/T4877的本部分规定了小麦印度腥黑穗病菌Tilletiaindica和小麦矮化腥黑穗病菌Tilletia controversa的DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。 本部分适用于小麦印度腥黑穗病菌和小麦矮化黑穗病菌的筛查 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18085植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法 GB/T28080小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码DNAbarcode 生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 3.2 内部间隔转录区序列internaltranscribed spacer;ITS 在真核生物中，核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成，其基因组序列从5到3 依次为：外部转录间隔区、18S基因内部转录间隔区1（ITS1）、5.8S基因、内部转录间隔区2（ITS2）、 28S基因和基因间隔序列。内转录间隔区是存在于18SrDNA、5.8SrDNA和28SrDNA之间的区 域ITS1和ITS2作为非编码区，受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点， 息服务平台 在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，能够提供 详尽的系统学分析所需的可遗传性状。 4检疫性腥黑粉菌的基本信息 英文名：QuarantineBunt 学名：Tilletia indica 中文名：小麦印度腥黑穗病菌 学名：Tilletia controversa 中文名：小麦矮化腥黑穗病菌 分类学地位：真菌界（Fungi）、担子菌门（Basidiomycota）、黑粉菌纲（Ustomycetes）、黑粉菌目（Usti- laginales）、腥黑粉菌科（Tilletiaceae）、腥黑粉菌属（Tilletia） 1 SN/T 4877.9—2017 5方法原理 查物种。 6仪器设备和试剂 6.1仪器设备 超净工作台、摇床、烘箱、高压灭菌锅、一20℃低温冰箱、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析 仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像系统、纯水器。 6.2试剂 氯仿、异戊醇、异丙醇、醋酸钠、甲酰胺、70%乙醇、无水乙醇、Tris饱和酚、TaqDNA聚合酶、明胶、 漠化乙锭、DNA片段标记物、DNA裂解液、PCR缓冲液、电泳缓冲液、上样缓冲液、dNTPs（dATP、 dGTP、dCTP、dTTP)、全基因组扩增试剂盒。 7筛查鉴定方法 7.1DNA制备 DNA制备方法见附录A。 7.2 2DNA条形码基因片段扩增 利用通用引物进行ITS片段序列扩增，具体步骤见附录B。 7.3 序列分析 测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，比对峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，去除两段 测序质量Q值小于20的序列，然后在生物条形码数据（BOLD)数据库或中国检疫性有害生物DNA条 形码数据库中比对分析。 8结果判定 ITS序列长度约为600bp。如果测定的序列与美国国家生物技术信息中心（NCBI)数据库中比对 （AF399890.1，序列参见附录C)相似度大于99%时，可初步判定为小麦印度腥黑穗病菌，进一步鉴定按 照标准GB/T28080进行；如果测定的序列与条码数据库中（AF398449.1,序列参见附录C)比对相似度 大于99%时，可初步判定为小麦矮化腥黑穗病菌，进一步鉴定按照标准GB/T18085进行 9菌种或标本保存 9.1样品保存 2