ICS 65.020.01 SN B 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5138—2019 棉花黄萎病菌检疫鉴定方法 Detetion and identification of Verticillium dahliae Kleb 业标准信息服务平台 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5138—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院、中华人民共和国宁波海关、中华人民共和国天津 海关、中国科学院微生物研究所、中华人民共和国乌鲁木齐海关、中华人民共和国青岛海关。 本标准起草人：段维军、郭立新、廖芳、蔡磊、李雪莲、张祥林、王英超、张慧丽、陈先锋。 业标准信息服务平台 SN/T5138—2019 棉花黄萎病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了棉花黄萎病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于植物及其产品中棉花黄菱病菌的检测鉴定。 2定义和术语 下列术语和定义适用于本文件 2.1 轮枝状分生孢子梗verticillateconidiophore 在直立的分生孢子梗每节基部膨大处轮生若干个小梗，一般1～5轮，是轮枝菌的分生孢子梗类型。 2.2 厚垣孢子chlamydospore 由菌丝个别细胞膨大形成，具有厚壁和浓缩的原生质，可抵抗不良环境的一种休眠孢子。 2.3 微菌核 microsclerotium 由单一菌丝体不断聚集的暗褐色或黑色较为坚硬的休眠体。 2.4 休眠菌丝体 restingmycelium 一种菌丝休眠体，暗褐色或近黑色，分隔规则，隔膜间膨大，呈念珠状。 业标准信 3基本信息 中文名：棉花黄娄病菌 学名：VerticilliumdahliaeKleb. 分类地位：棉花黄萎病菌隶属于真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota），盘菌亚门（Pezizomycoti na），粪壳菌纲（Sordariomycetes）中的小不整球壳科（Plectosphaerellaceae）。 传播途径：棉花黄萎病菌主要由种子传播，也可经土壤、病残体、风、灌溉水和昆虫传播 近似种：黑白轮枝菌Verticilliumalbo-atrumReinkeandBerthold、三体轮枝菌V.tricorpusIsaac、 变黑轮枝菌V.nigrescensPethybridge、云状轮枝菌V.nubilumPethybridge等。 4鉴定原理 棉花黄萎病菌的危害症状、形态学特征及分子生物学特征是鉴定该病菌的依据。 5仪器和试剂 5.1仪器 高压灭菌锅、显微镜、解部镜、天平、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡振荡器、台式离心机、 1 SN/T5138—2019 核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、真空干燥仪、冰箱、超净工作台、生化培养箱、通风橱、实时荧光PCR 仪、凝胶成像仪、微量移液器（0.1l~2.5μ,lμl～10μL,10μ~50μ，20l～200μl，100μl~ 1000μL）、锥形瓶、试管、培养皿、载玻片、盖玻片。 5.2试剂 CTAB提取液（2%CTAB，1.4mol/LNaCl20mmol/KEDTA，100mmol/LTris·HCl pH8.0）、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、次氯酸钠、RNase、PCR反应试剂：2XTaqMan Universal PCR Master Mix 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 5.3培养基 PDA培养基。 6检疫鉴定 6.1分离培养 无菌水冲洗3次后置于灭菌滤纸，吸干水分后放置于倒有PDA的培养皿中。培养皿倒置在25℃光照 培养箱中培养。分离出可疑菌落后转接纯化培养。 6.2形态学观察 显微镜检孢子的形态特征、产孢方式。不 分生孢子梗和微菌核的形成情况。 6.3DNA制备 采用基因组提取试剂盒制备DNA，或采用改良的CTAB提取法，参见附录A。 6.4实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测方法参见附录B。 7鉴定特征 7.1 症状 植株受棉花黄萎病菌侵染后，维管束变褐色，该特征是维管束病害的典型特征。受棉花黄萎病菌侵 染，植物叶片急剧失水，叶片呈花西瓜皮状，特别是顶部叶片常半边水烫状，不久整株迅速萎焉。 7.2形态学鉴定特征 菌落呈绒毛状，初生菌丝体无色或白色，有隔膜。培养10天以上菌落可产生大量微菌核，菌落变为 黑褐色。分生孢子梗轮状分枝，1～5轮，分枝基部膨大，始终透明，顶端着生分生孢子，无色，单胞，椭圆 形或近圆筒形。形态特征参见附录C和D。 7.3实时荧光PCR结果判定 在阴性对照、空白对照正常的情况，则有如下判定： 2