ICS 65.020.01 SN B 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5139—2019 马铃薯斑纹片病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of CandidatusLiberibacter solanacearum 业标准信息服务平台 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5139—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国满洲里海关，中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国呼和浩 特海关。 本标准主要起草人：刘玮琦、赵文军、田茜、潘绪斌、杨永生、杭小溪、刘文敏、张贵、孟斌。 业标准信息服务平台 SN/T5139—2019 马铃薯斑纹片病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了马铃薯斑纹片病菌的检测方法。 本标准适用于进境马铃薯、番茄、辣椒等茄科植物，以及胡萝卜、芜要、芹菜等伞形科植物的种子、种 苗、块茎、块根等植物材料以及传播介体木虱中马铃薯斑纹片病菌的检疫鉴定。 2马铃薯斑纹片病菌基本信息 中文名称：马铃薯斑纹片病菌 拉丁学名：CandidatusLiberibactersolanacearumLieftingetal.，2oog 英文名称：zebrachip，zebracomplex 中文异名：斑马片病、马铃薯斑纹菌 同物异名：CandidatusLiberibacterpsyllaurousHansenetal.，2008 分类地位：属原核生物界（KingdomMonera），变形菌门（Proteobacteria），α-变形菌纲（Alphapro teobacteria），根瘤菌目（Rhizobiales），叶杆菌科（Phyllobacteriaceae），韧皮部杆菌属（Candidatus Liberibacter)。 传播途径：马铃薯木虱、胡萝卜木虱、Bactericeratrigonica和B.maculipennis等木虱是马铃薯斑 纹片病的传播介体，其通过取食染病植物携带病菌并进行传播。此外，还可随种子、种苗、块茎和块根等 繁殖材料远距离传播，也可通过嫁接传播。 马铃薯斑纹片病菌其他信息参见附录A，病害症状及传播介体图片参见附录B。 示准信 3方法原理 4仪器设备和主要试剂 4.1仪器设备 超净工作台、高速冷冻离心机、研磨机、小型研磨仪、拍打式均质仪、台式小型离心机、常规冰箱、旋 涡震荡器、微量进样器、电子天平、pH计、水浴锅、纯水仪、高压灭菌器、超低温冰箱、荧光定量PCR仪、 PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析仪、制冰机等。 4.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。TritonX-1oo、PBS缓冲液、PCR缓冲液、dNTPs（dATP、 dTTP、dCTP、dGTP）、TaqDNA聚合酶、引物和探针、异丙醇、无水乙醇、DNA提取试剂见附录C。 1 SN/T 5139—2019 5病菌的鉴定 5.1症状检查 取样品量1%～5%（若样品少可适当增大比例）的叶片、茎秆和块茎等部位进行检查。在不同寄主 甚至同一寄主不同品种上的为害症状及为害程度均有差异。症状参见附录A和附录B。 5.2样品制备 5.2.1植株材料样品制备 植物材料用研磨仪或液氮进行匀浆处理，从有症状的植物上取3片-5片植物叶片或茎。在无症状 的植物上不同部位取5片-10片叶子（包括新生的叶片）或茎秆。选取症状明显的植物地下部分进行检 束组织，例如：叶柄，叶中脉，形成层，或马铃薯块茎维管束环等。 5.2.2种子样品制备 种子样品可用研钵研磨，也可用研磨机处理，或置塑料袋内用锤子粉碎。或采用拍打式均质仪处理 代替研磨。种衣剂处理过的种子应先去除种衣，将种子在1：10（w/v）0.5%TritonX-100中振荡洗涤 30min，洗3次后在水中过夜软化。1g-2g胡萝卜种子（约450粒-900粒）样品加人50mL-100mL PBS(NaCl,8 g /L; NaH,PO4:2H,O,0.4 g/L; Na,HPO4: 12H,O,2.7 g /L;pH7.2)缓冲液 4 ℃ 冰箱浸泡过夜；弃缓冲液，种子用研磨仪研磨处理，研磨后加20mL-40mLPBS缓冲液，震荡混匀，纱布 或滤纸过滤，滤液用于提取DNA。 也可用PBS缓冲液（NaCl,8g/L；KHzPO4，0.24g/L；NazHPO4，1.44g/L；KCl,0.2g/L; pH 7.2)。 5.2.3木虱样品制备 取10只-30只木虱放入离心管中加适量裂解液用小型研磨仪研磨，或放在研钵中加人液氮研磨 备用。 5.3PCR初筛 5.3.1样品DNA提取 取植物组织或种子处理液过滤后的滤液1mL-2mL，10000r/min离心5min，沉淀提取DNA。可 用常规的CTAB提取方法，也可用商用DNA提取试剂盒。木虱样品制备后可用商业化试剂盒提 取 DNA。 5.3.2分子生物学检测 本标准采用常规PCR、巢式PCR和实时荧光PCR检测方法，分别见附录C、D和E，重复3次。用 马铃薯斑纹片病菌DNA作阳性对照，用健康马铃薯DNA作阴性对照，用灭菌蒸馏水作空白对照。 6结果判定 若常规PCR、巢式PCR和实时荧光PCR三种检测方法，任一方法检测为阳性，可判定检出马铃薯 斑纹片病菌。 2