SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4729—2016 杜鹃芽枯病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Seifertia azaleae (Peck)Partridge and Morgan-Jones 行业标准信息服务平台 2016-12-12发布 2017-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4729—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准起草人：吴品珊、杜洪忠、雷荣、邵思、严进、张秋娥 行业标准信息服务平台 1 SN/T4729—2016 杜鹃芽枯病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了杜鹃芽枯病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于针对杜鹃属（RhododendronL.）植物的花芽、叶芽和嫩枝中携带的杜鹃芽枯病菌的 检疫鉴定。 2病菌的基本信息 2 学名：Seifertiaazaleae(Peck)PartridgeandMorgan-Jones 英文名：Bud blight,Bud and twigblight 分类地位：真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，散囊菌纲Eurotiomycetes，刺盾目Chaetothyri- ales，小蔓毛壳科Herpotrichiellaceae 传播途径：病菌主要在病芽上存留或越冬。翌年由芽鳞基部侵人寄主，并进入髓部，阻碍梢枝水分 输导，使芽、梢枯萎。近距离主要由媒介昆虫如叶蝉、蜜蜂等和雨水滴溅传播。远距离传播主要通过带 病植株传播。 杜鹃芽枯病菌的其他信息参见附录A。 3方法原理 以杜鹃芽枯病菌的形态学特征和ITS基因序列比对特征为鉴定依据。 仪器设备和用具 4 4.1 仪器设备 生物显微镜（具测量功能）、体视显微镜超净工作台、生物培养箱、天平、高压灭菌锅、台式高速离心 机、pH计、水浴箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪。 4.2用具 烧杯、锥形瓶、量筒、试管、培养皿、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、接种针、载玻片、盖玻片、塑料研杆、 移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐。 5试剂和培养基 5.1试剂 葡萄糖、琼脂粉、次氯酸钠、硫酸链霉素、液氮、Tris-HCI、MgClz、HCI、EDTA、NaOH、NaOAC、 KCl、Tris、CTAB、TAE、无水乙醇（Ethanol）、苯酚（Phenol）、漠化乙锭（EB）、氯仿（Chloroform）、异丙醇 (Isopropanol)、异戊醇(Isoamyl alcohol)、蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物ITS5/ITS4。 1 SN/T4729—2016 5.2培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），链霉素马铃薯葡萄糖琼脂培养基（SPDA）。具体配方参见附 录 B。 6检疫鉴定方法 6.1症状检查 观察杜鹃花的花芽是否有变褐、水浸状或枯萎症状，芽鳞外面是否有小黑点。检查嫩枝是否有枯萎 的症状。病害症状参见附录A和附录C。 6.2分离培养 取疑似症状的杜鹃花的花芽和嫩枝，分别用0.5%次氯酸钠表面消毒1min，灭菌水冲洗3次，置于 含链霉素的SPDA培养基平皿中，20℃培养，3d～5d开始后观察。待真菌菌落出现，取菌落边缘菌 丝，转移至PDA上纯化3次备用。 6.3形态学鉴定 在PDA上培养一周后观测菌落的特征，记录分生孢子、产孢细胞形状、大小等。培养皿至少观察5 周至7周。 6.4分子生物学鉴定 6.4.1DNA提取 按CTAB方法提取DNA参见附录D。 6.4.2PCR反应及序列比对 利用真菌通用引物1ITS5（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3）进行扩增。 25μL反应体系中含：样品DNA1μL(1ng~50ng），10XPCRbuffer2.5μL，25mmol/LMgCl 2 μL,2.5 mmol/L dNTps 2 μL,10 μmol/LPrimers 各 0.5 μL,5U/μL Taq DNA poLymerase 0.2 μL, ddH,O16.3μL。同时要设置阴性对照，以TrisEDTA缓冲液代替DNA样品。 PCR反应条件为：预变性，94℃4min→变性，95℃1min，退火56℃30s、72℃45s.35个循 环→72℃10min→4℃保存。 PCR产物的检测在1×TAE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm，0.5%EB染色20min， 凝胶成像仪分析结果。如有目标片段大小的单带出现，将扩增产物进行序列测定、 将测序获得的序列与美国国立生物技术信息中心（NCBI)网站DNA序列数据库（GenBank）中公开 发表的Seifertiaazaleae的序列进行同源性比对分析。 7鉴定特征 7.1天 形态学特征 杜鹃芽枯病菌在PDA培养基上的菌落呈橄榄色至深灰褐色，质地毛茸。 杜鹃芽枯病菌的孢囊梗束丝黑色、大小为0.5mm~2.5mm×250uμm~500μm，顶端产生大量的 2