SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4877.7—2017 基因条形码筛查方法 第7部分：检疫性轮枝菌 DNA barcoding screening method-Part 7:Quarantine Verticillium 行业标准信息服务平台 2017-08-29发布 2018-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4877.7—2017 前言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10部分： 第1部分：检疫性棒形杆菌； 第2部分：检疫性黄单胞菌； 第3部分：检疫性植原体； 一第4部分：检疫性茎点霉； 第5部分：检疫性拟茎点霉； 第6部分：检疫性嗜酸菌； 第7部分：检疫性轮枝菌； 第8部分：检疫性炭疽菌； 第9部分：检疫性腥黑粉菌； 第10部分：检疫性疫霉。 本部分为SN/T4877的第7部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。 本部分起草人：高瑞芳、章桂明、汪莹、程颖慧、王颖、卢小雨、向才玉、潘广。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4877.7—2017 基因条形码筛查方法 第7部分：检疫性轮枝菌 1范围 SN/T4877的本部分规定了棉花黄病菌和首黄萎病菌DNA条形码筛查中序列的扩增、分析 及结果判定等 本部分适用于检疫性轮枝菌的DNA条形码筛查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T28084棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定 SN/T1145首猎黄萎病检疫鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码DNAbarcode 生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 3.2 内部转录间隔区序列internaltranscribed spacer;ITS 在真核生物中，核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成，其基因组序列从5到3” 依次为：外部转录间隔区，18S基因、内部转录间隔区1（ITS1）、5.8S基因、内部转录间隔区2（ITS2）、 28S基因和基因间隔序列。内转录间隔区是存在于18SrDNA、5.8SrDNA和28SrDNA之间的区 域，ITS1和ITS2作为非编码区，受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点， 在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，能够提供 准信息服务平 详尽的系统学分析所需的可遗传性状。 4检疫性轮枝菌基本信息 学名：VerticilliumdahliaeKleb 中文名：棉花黄萎病菌 学名：Verticilliumalbo-atrumReinkeetBerthold 中文名：首黄萎病菌 分类地位：真菌界（Fungi），丝孢纲（Hyphomycetes），丝孢目（Hyphomycetales），淡色孢科（Monili aceae），轮枝孢属（Verticillium） 寄主范围参见附录A。 5方法原理 使用ITS片段作为棉花黄萎病菌和首黄萎病菌的DNA条形码基因，通过对检测对象的DNA进 1 SN/T 4877.7—2017 行PCR扩增及产物测序后，利用DNA条形码数据库生物条形码数据（BOLD)或中国检疫性有害生物 DNA条形码数据库比对，根据序列相似度筛查物种。 6仪器设备和试剂 6.11 仪器设备 超净工作台、高压灭菌锅、4℃冰箱、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳仪、凝 胶成像系统。 6.2试剂 CTAB提取液、三氯甲烷、乙醇、PCRTaqDNA聚合酶、PCRTaq缓冲液、dNTP、DNA标记物、无 菌超纯水。 7筛查鉴定方法 7.1DNA提取与纯化 对真菌进行液体培养或平板培养，CTAB法对基因组DNA的提取方法详见附录B，测定DNA浓 度及纯度后，保存于一20℃冰箱备用。 7.2DNA条形码片段PCR扩增 利用通用引物进行ITS片段序列扩增（具体步骤参见附录C），测序 7.3序列分析 测序结果利用BioEdit等生物信息学软件进行剪接编辑，比对峰图和正反向测序结果是否有误，去 掉两端引物部分序列，然后在BOLD数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中比对分析。 8结果判定 ITS序列长度500bp左右，在生物条形码数据库BOLD和中国检疫性有害生物DNA条形码数据 库中进行比对，若与DNA条码数据库中检疫性轮枝菌序列相似度大于99%时，即可以筛查判定是该物 种。棉花黄菱病菌和首黄萎病菌DNA条形码参考序列参见附录D。 若判定为目标检疫性轮枝菌，应结合GB/T28084和SN/T1145进行最终鉴定。 9样品保存 9.1样品保存 分离得到的菌种转移到马铃薯葡萄糖斜面培养基上，置于4℃黑暗条件下保存至少12个月，以备 复验、谈判和仲裁。 9.2 2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。 2