ICS 65.020.30 SN B 41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5110—2019 仙台病毒病检疫技术规范 Quarantine protocol for Sendai virus infectious disease 业标准信息服务平台 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5110—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海海关、中华人民共和国广州海关。 本标准主要起草人：蒋静、王艳、宋青、田纯见、黄忠荣、李健、王巧全、林颖、张强、熊炜。 业标准信息服务平台 SN/T 5110—2019 仙台病毒病检疫技术规范 1范围 本标准规定了鼠仙台病毒病RT-PCR检测、Real-timeRT-PCR检测、免疫荧光试验、血凝抑制试 验的操作方法。 本标准适用于鼠仙台病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3临床诊断 鼠感染仙台病毒病临床上主要有两种不同的感染类型，可据此进行初步诊断： 慢性型：呈地方性流行，病毒在鼠群中长期存在。多见于断乳后不久的至42d的小鼠，通常为亚临 床感染，病毒存活14d左右。 急性型：常表现临床症状，在较短的时间内自愈或者转为地方流行。病鼠常表现为被毛粗乱，弓背， 呼吸困难，眼角有分泌物，发育不良，消瘦等症状，怀孕母鼠妊娠期延长，新生乳鼠死亡率增加。 大体解观察：主要病变出现丁呼吸道和局部淋巴结，肺呈杨梅色，切开时有泡沫状血样液体流出。 病交多见于尖叶，膈叶和心叶 组织病理学观察：分为三个阶段，急性阶段表现为炎症反应和靶细胞溶解；修复阶段表现为再生的 靶细胞上皮增生；恢复阶段表现为实质斑痕化收缩。 隹信息 4采样和样品前处理 采集病鼠口鼻液、血液、粪便，以及肝、脾、肺、肾等组织器官。粪便或组织样品加等体积生理盐水 （附录A.1)研磨匀浆，3，000g离心15min，收集上清液待检。口鼻腔拭子、粪拭子用1mL生理盐水浸 润后，取上清液待检。取鼠尾静脉血或动脉血，室温静置30min，1，000g离心10min，取上清作为待检 血清样品。 51 RNA抽提及cDNA模板制备 5.1试剂与设备 除特别说明外，实验用水应符合GB/T6682要求。 5.1.1Trizol试剂：4℃保存。 5.1.2氯仿、丙酮：常温保存。 5.1.3异内醇：使用前预冷至一20℃。 SN/T 5110—2019 5.1.4 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，使用前预冷至一20℃。 5.1.5逆转录酶及10倍逆转录酶浓缩缓冲液：逆转录酶浓度为50U/uL，一20℃保存，避免反复冻融。 5.1.6 RNA酶抑制剂：浓度为40U/uL，一20℃保存，避免反复冻融。 5.1.7 随机引物：含有9个碱基的随机序列引物，浓度为50umol/L，一20℃保存。 5.1.8 DEPC水：自配（见附录A,2）或购买商品化试剂。 5.1.9 高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达13000g以上。 5.2RNA抽提 分别取100uL待检样品匀浆上清液，以及鼠仙台病毒阳性样品和阴性样品的上清液，加人1mL Trizol试剂，用枪头充分吹打20～30次；加入200μL氯仿，涡旋震荡30s混匀；13000g离心15min； 取上层水相，加500μL异丙醇，上下颠倒数次混匀，一20℃放置20min；13000r/min离心10min；弃 10min；加30μLDEPC水溶解RNA沉淀。RNA溶液应尽快用于逆转录合成cDNA模板。商品化 RNA提取试剂盒同样适用于本标准的RNA抽提。 5.3cDNA模板制备 取18.5μLRNA溶液，加10倍逆转录酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP1μL、随机引物（或待扩增引物 对的下游引物)1μL、RNA酶抑制剂1μL、逆转录酶1μL。混匀后,置PCR仪上经42℃40min、70℃ 6RT-PCR检测及结果判定 6.1试剂、材料与设备 出版文 6.1.1Taq酶及10倍Taq酶浓缩缓冲液：Taq酶浓度为5U/μL，一20℃保存，避免反复冻融。 6.1.2dNTP:含dATP、dGTP.dCTP.dTTP各10mmol/L，-20℃保存。 6.1.3RT-PCR引物：引物浓度均为20μmol/L,扩增基因片段大小为490bp，其序列如下： 上游引物(SeVF):5’ATG AGG ATAACG GTA CTG TGG AGC 3'; 下游引物(SeVR):5'GTC CCA TTG ACA AACACC ACT CTG 3'。 6.1.4EB溶液：4℃保存（见附录A.3）。 6.1.5 PCR 仪。 6.2PCR检测体系配制 在0.2mLPCR薄壁管或八联管中，按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5μLdNTP0.5μL、 18.5uL配制PCR检测体系。阳性、阴性和空白对照的检测体系同样配制。 6.3PCR检测的反应条件 首先94℃变性3min；再94℃30s.56℃30s、72℃40s进行35个循环；然后72℃3min。 6.4琼脂糖凝胶电泳 用0.5倍TBE电泳缓冲液配制浓度为1.5%的琼脂糖（含0.5ug/mLEB)凝胶平板，将该凝胶平板 放入水平电泳槽，使缓冲液刚好没过胶面，电泳缓冲液工作浓度为0.5倍TBE（见附录A.4）。在9uL PCR产物中加入1uL1O倍电泳上样缓冲液，然后加至凝胶平板的样品孔，同时设定DNA分子量标准 2