ICS 67.050 SN C 53 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5145.6—2019 出口食品及饲料中动物源成分快速 检测方法 第6部分：牛成分检测 PCR-试纸条法 Rapid Identification of animal ingredient in export food and feed Part 6 :Detection of Bovine Ingredient PCR-Lateral flow dipstick method 业标准信息服务平台 2019-10-25发布 2020-05-01实施 中华人民共和国海关总署发布 SN/T 5145.6—2019 前言 SN/T5145《出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法》分为以下13个部分： 第1部分：猫成分检测PCR-试纸条法； 第2部分：貂成分检测PCR-试纸条法； 第3部分：鹿成分检测PCR-试纸条法； 第4部分：骆驼成分检测PCR-试纸条法； 第5部分：狗成分检测PCR-试纸条法； 第6部分：牛成分检测PCR-试纸条法； 第7部分：绵羊成分检测 PCR-试纸条法； 第8部分：驴成分检测PCR-试纸条法； 第9部分：狐狸成分检测PCR-试纸条法； 第10部分：鹅成分检测PCR-试纸条法； 第11部分：鸭成分检测PCR-试纸条法； 第12部分：火鸡成分检测PCR-试纸条法； 第13部分：鸽子成分检测PCR-试纸条法； 本部分是SN/T5145的第6部分。 文本为准 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口 本部分起草单位：中华人民共和国天津海关，天津师范大学，中国检验检疫科学研究院，北京华大蛋 白质研发中心有限公司。 本部分主要起草人：郑文杰、张霞、庞璐、刘培、赵良娟、李宗梦、张宏伟、陈颖、尹长城、孙金生。 标准信息服务平台 I SN/T5145.6—2019 出口食品及饲料中动物源成分快速 检测方法第6部分：牛成分检测 PCR-试纸条法 1范围 本部分规定了食品及饲料中牛源性成分检测的PCR-试纸条方法。 本部分适用于肉、肉制品及饲料中牛源性成分的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T27403—2008实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 3.1.1 牛Bovine 属于哺乳纲，偶蹄目，牛科，牛属。本标准中牛成分即指牛特异性DNA片段。 信息服务平台 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：deoxyribonuleicacid，脱氧核糖核酸。 dNTP：deoxyribonuleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸 CTAB：cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基漠化铵。 Tris：Tris(Hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。 EDTA:Ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸 FITC：Fluorescein5-isothiocyanate，异硫氰酸盐。 4方法原理 利用裂解液破碎样本细胞，苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，以提取的DNA为模板，采用上游和下游 引物分别经异硫氰酸盐（Fluorescein5-isothiocyanate，FITC）和生物素（Biotin）标记进行PCR扩增，获 得两端分别带有异硫氰酸盐和生物素分子的PCR产物。用含有金标记的抗异硫氰酸盐的免多克隆抗 1 SN/T 5145.6—2019 确证。 试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。 5.1牛源性成分检测用引物（对）序列及标记物为： 牛成分扩增引物详见表1。 表1试验用引物 物种名称 引物序列（5'→3'） 5'端标记物 靶基因 F:5'-TGGAGTAATCCTTCTGCTCAC-3' 异硫氰酸盐（FITC) 牛 CYTB R:5'_GCAAGAATTAGGATAGAGAAGG-3 生物素（biotin） 5.2试剂 为准 5.2.1ExTaqHotStartDNA聚合酶（Tag,Termusauaticu)。 5.2.2 dNTPs：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸）、dCTP（deoxyadenosinecytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、 dGTP（deoxyguannosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）。 5.2.4 三氯甲烷（氯仿）。 5.2.5 异丙醇。 5.2.6 CTAB提取液:20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Na2EDTA,pH 8.0。 5.2.7 CTAB沉淀液:5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCl,pH 8.0。 5.2.8 酚/三氯甲烷/异戊醇溶液：按照Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为25：24：1进行 配制。 5.2.9 三氯甲烷/异戊醇溶液：按照三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为24：1进行配制。 5.2.10 70%乙醇(V/V)。 5.2.11 NaCl溶液(1.2 mol/L)。 5.2.12 蛋白酶K（20mg/mL）。 5.2.13 试纸条：含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸 条，可通过采购的原料试剂自行组装（参见附录A）或采用等效的商品化试纸条。 5.2.14展开液：10mmol/LTris、1%BSA，1%（v/v)Tween20以及浓度为0.05mol/L的NaOH；或采 用等效的商品化产品。 61 仪器设备 6.2微量移液器（100μl1000μL20μ~200μl,2μL~20μL,0.5μL~10μL。 6.3 PCR 仪。 2