ICS 11.220 B 43 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB13/T 2593—2017 禽腺病毒 4 型 PCR 检测方法 2017 - 11 - 22 发布 河北省质量技术监督局 2017 - 12 - 22 实施 发 布 DB13/T 2593—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北农业大学提出。 本标准起草单位：河北农业大学。 本标准主要起草人：袁万哲、王建昌、孙继国、刘聚祥、李丽敏、陈立功、李睿文、张磊、白云、 陈赛娟、李杰峰。 I DB13/T 2593—2017 禽腺病毒 4 型 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了禽腺病毒4型PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽腺病毒4型。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） 2.2 EB 溴化乙锭（ethidium bromide） 2.3 PCR 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） 2.4 dNTP 脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） 3 试剂或材料 包括各种市售病毒核酸提取试剂盒，1.0 %琼脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭（EB，10 ug/μL） 或核酸染料，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，DNA分子量标准（100 bp），2×Taq MasterMix 或商品化的一步法PCR反应试剂。 警示:电泳中用到的EB在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要进行无害化处理；DEPC 在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。 3.1 病毒核酸提取试剂盒。 3.2 1.0 %琼脂糖凝胶，配制方法见附录 A 中 A.1。 3.3 50×TAE 缓冲液，配制方法见附录 A 中 A.2。 3.4 溴化乙锭（EB，10 ug/μ L）或核酸染料，配制方法见附录 A 中 A.3。 3.5 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，配制方法见附录 A 中 A.4。 1 DB13/T 2593—2017 3.6 DNA 分子量标准（100 bp）:包含 100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp、2000bp 几种分 子量标准。 3.7 2×Taq MasterMix。 3.8 商品化的一步法 PCR 反应试剂：含有 PCR 缓冲液、酶混合物、dNTP 混合物、无 RNA 酶的水等。 3.9 引物：上游引物与下游引物见附录 B 中的表 B.1。引物浓度为 10 μ mol/L。 4 仪器设备 4.1 PCR 仪：温度范围 4.0℃～99.9℃；样品基座配置至少包括单个 0.2 mL 孔。 4.2 凝胶成像系统：检测灵敏度 DNA ≥0.1 ng；有效像数 1360×1024、10bit、USB 2.0。 4.3 台式低温高速离心机：最高转速 16000 r/min；容量 1.5 mL × 12。 4.4 电泳仪：电压 50 V～120 V，电流 10 mA～800 mA，定时 0min～999min。 4.5 电泳槽:耐高温、耐腐蚀、不漏液；缓冲液容量充足。 4.6 冰箱:具有冷藏功能。 4.7 微量移液器:单道可调；量程包括 0.5～10 μ L、2～20 μ L、10～100 μ L、100～1000 μ L。 4.8 水浴锅:温度范围为室温～100℃。 5 样品 5.1 阴阳性对照 以灭活的禽腺病毒4型鸡胚尿囊液作为阳性对照，以正常鸡胚尿囊液或者是正常家禽组织作为阴性 对照。对照均应在-20℃保存。 5.2 样品的采集与处理 5.2.1 采集工具 下列的采集工具应经121℃±2℃，20 min高压灭菌并烘干： a) 棉拭子； b) 剪刀； c) 镊子； d) 1.5 mL 离心管； e) 研钵。 5.2.2 棉拭子采集 将棉拭子深入咽喉或肛门转一圈； 将采集后的棉拭子放入盛有1.0 mL PBS （配制方法见附录A中A.5） 的1.5 mL的离心管，加盖，编号。 5.2.3 组织采集 2 DB13/T 2593—2017 剖检家禽，用剪刀采集心肝脾肺肾法氏囊等组织，装入一次性灭菌容器，编号。 5.2.4 样品储运 样品采集后放入塑料袋内密封（一个采集点的样品放一个塑料袋内），于保温箱中加冰，密封24 h 内送至实验室。 5.2.5 样品的处理 5.2.5.1 棉拭子处理方法 将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出， 4℃条 件下3000 r/min离心15 min，取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中，编号备用。 5.2.5.2 组织的处理方法 将所采集的组织置于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比（1:5）加入样品保 存液进行充分研磨，4℃条件下3000 r/min离心15 min。取上清转入无菌的1.5 mL的离心管备用，编号。 6 操作步骤 6.1 DNA 的提取 用病毒核酸提取试剂盒，按照如下步骤提取待检样品、阳性对照及阴性对照样品的DNA。 6.1.1 加入 20 μ L 蛋白酶 K 于 1.5 mL 离心管中，在离心管中加入 200 μ L 样品，加入 200 μ L BB5， 涡旋混合 15 s，56℃孵育 15 min。 6.1.2 加入 250 μ L 无水乙醇，涡旋混合 15 s，室温放置 5 min。 6.1.3 将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000 r/min 离心 1 min，弃掉流出液。 6.1.4 加入 500 μ L WB5,12000 r/min 离心 1 min，弃掉流出液，重复一次。 6.1.5 室温 12000 r/min 离心 1min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置 1 min～3 min 彻底晾干离心 柱。 6.1.6 将离心柱转入 1.5 mL 离心管中，并向离心柱中央加 20 μ L RNase-free Water，室温静置 1min。 6.1.7 室温 12000 r/min 离心 1min，洗脱 DNA，-20℃贮存备用。 6.2 PCR 在反应管中依次加入8 μL无核酸酶水、10 μL 2×Taq MasterMix、1 μL上述DNA溶液、0.5 μL 10 µmol/L 的上游引物、0.5 μL 10 µmol/L的下游引物，最终至总体积为20 μL。经充分混匀后瞬时离心，使液 体全部聚集于管底。 PCR扩增条件：94℃预变性3 min，94℃变性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸57 s，循环30次；72℃ 延伸5 min。扩增反应结束后立即进行电泳或置于4℃条件下备用。 7 试验数据处理 3 DB13/T 2593—2017 7.1 扩增产物的电泳检测 制备1.0 %琼脂糖凝胶板。在电泳槽内加入1×TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取3 μL～5 μL 扩增产物加到凝胶孔，加入DNA分子量标准（100 bp）。恒压（110V）电泳30 min～40 min，将电泳好 的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。 7.2 结果判定 阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性的条带；阴性的扩增产物 没有预期的目的条带；阴阳性同时成立表明试验有效，否则试验无效。在试验结果成立的前提下，如 果样品的PCR产物电泳后在954 bp位置出现特异性的条带，则判定为禽腺病毒4型核酸检测阳性；如果 样品的PCR产物电泳后在954 bp位置未出现特异性的条带，则判定为禽腺病毒4型核酸检测阴性。PCR 产物电泳图见附录C中C.1。 8 试验报告 依次陈述试验对象、所使用的标准（包括发布或出版年号）、所使用的方法、检测结果、与试验 时间等。 4 DB13/T 2593—2017 附 录A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 1.0 %琼脂糖凝胶 称取琼脂糖1.0 g，放入100 mL 1×TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60℃时，加入5 μL核 酸染料，均匀铺板，厚度为3 mm～5 mm。 A.2 50×TAE 电泳缓冲液 A.2.1 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0） 称取EDTA 18.61 g，加灭菌双蒸水至100 mL，后用氢氧化钠调pH至8.0。 A.2.2 TAE 电泳缓冲液（50×） Tris 242 g，冰乙酸57.1 mL，0.5 mol/L EDTA 100 mL，加灭菌双蒸水至1000 mL。 A.3 溴化乙锭（EB）溶液 溴化乙锭20 mg，加灭菌双蒸水至20 mL。 A.4 DEPC 水 焦碳酸二乙酯（DEPC）50 μL，加灭菌双蒸水至100 mL，室温放置6 h～8 h，121℃±2℃高压灭 菌20 min，分装到1.5 mL DEPC处理过的离心管。 A.5 PBS 缓冲液 A.5.1 A 液（0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4·H2O 27.6 g 先用适量蒸馏水溶解，最后用 蒸馏水稀释至 1000 mL。 A.5.2 B 液（0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO4·7H2O 53.6 g，（或 Na2HPO4·127H2O 71.6 g 或 Na2HPO4·2H2O 35.6 g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至 1000 mL。 A.5.3 0.01 mol/L pH 7.2 磷酸盐缓冲液的配制：A 液 14 mL， B 液 36 mL，加氯化钠（NaCl） 8.5 g，最后用蒸馏水稀释至 1000 mL。 5 DB13/T 2593—2017 附 录B （规范性附录） 引 物 表B.1规定了上游引物和下游引物的浓度和序列。 表 B.1 上游引物和下游引物的浓度和序列 6 引物名称 引物浓度 序列（ 5'- 3'） 上游引物 10 μ mol/L CCG ACC GTT ACA AGT TTA GCA T 上游引物 10 μ mol/L TTC GCA GGA AGT CGT AGT GGA DB13/T 2593—2017 附 录C （规范性附录） 禽腺病毒 4 型 PCR 产物电泳图 说明： M——DNA分子量标准（100 bp）； 1——阳性对照； 2——阴性对照。 图 C.1 禽腺病毒 4 型 PCR 产物电泳图 _________________________________ 7